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蛋白質的離心過濾
時間:2020-01-16 10:21:41   來源:www.eljakalito.com   點擊:
如何使用離心過濾器
當開始大量濃縮時,讓它先旋轉5分鐘,以確定溶液流過過濾器的速度,然后用它來決定旋轉所需的時間。zui好先旋轉不超過15分鐘,然后用移液管輕輕混合樣品2-3次,以避免堵塞膜,從而避免在此階段損失您的辛勤工作和金錢。當混合時,你會看到靠近膜的粘性更大的蛋白質溶液漩渦上升并擴散到濃度較低的溶液中。移液時,特別注意不要用移液器尖端接觸和破壞膜,并且只能從過濾器邊緣移液。

離心過濾器故障排除
蛋白質沉淀
人們在使用離心過濾器時面臨的一個常見問題是蛋白質沉淀的問題。這主要是因為濃縮時蛋白質梯度的形成和膜附近的局部高濃度。如上所述,可以通過定期混合溶液來避免這種情況。

另外,確保緩沖液的酸堿度不要太接近你感興趣的蛋白質的等電點。

最后,確保緩沖液中的DTT是新制成的。DTT在pH 8.0時不穩定,隨著時間的推移可能失活。因此,二硫鍵的形成可能以隨機和非自然的方式開始,并因此形成不同的蛋白質二硫化物低聚物,其可能是不溶的。


蛋白質與離心過濾膜的結合
這一特性很大程度上取決于過濾器膜的組成,無論是聚砜、聚酯砜還是再生纖維素。就我個人而言,避免再生纖維素,因為我發現蛋白質與膜的結合是這些過濾器更大的問題。許多人添加0.1%(體積比)吐溫20或Triton X-100來緩解這個問題。為了提高樣品的濃縮速度,同時使用幾個離心過濾器是很有誘惑力的,但這不是一個好主意,因為這可能會由于蛋白質與膜結合的潛在問題而增加損失。

zui后,濃縮蛋白質后,檢查濃度通過獲取280納米處的吸光度或使用布拉德福測定法,以方便和可用的為準。
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